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妊娠末期B族链球菌检测方法的评估 妊娠末期B族链球菌检测方法的评估
张静华， 袁应华， 成 洁， 孙奋勇
（同济大学附属第十人民医院检验科，上海 200072）
摘要：目的 对妊娠末期孕妇B族链球菌（GBS）的检测方法进行评估。方法 对产检的300例妊娠末期孕妇的生殖道分泌物样本分别用肉汤增菌转种血平板法、GBS筛查培养基法及聚合酶链反应（PCR）进行GBS检测，对各方法进行评估。结果 肉汤增菌转种血平板法和GBS筛查培养基法的GBS阳性检出率分别为5.3%和7.0%，二者差异无统计学意义（P＞0.05）；PCR GBS阳性检出率为9.6%，与2种细菌培养法阳性检出率差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 PCR是妊娠末期孕妇常规检测GBS感染的首选方法，可用于孕妇临产前的快速检测。
关键词：聚合酶链反应；细菌培养；B族链球菌；妊娠末期
B族链球菌（group B Streptococcus，GBS）又称无乳链球菌，为革兰阳性链球菌，是围产期严重感染性疾病的主要致病菌之中药调理能助孕吗一[1]。孕妇GBS感染与早产、胎膜早破、产褥感染和新生儿败血症等疾病的发生密切相关[2]。由于美国疾病预防控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）制定了围产期GBS的防治指南，所以目前已经在很大程度上减少了围产期孕妇GBS感染的发生率[3]。鉴于GBS在产科临床上的重要意义，其相应的菌株分离、培养和鉴定引起了临床的关注。本研究旨在通过对GBS检测方法的评估，为更快速、准确地鉴定GBS，合理应用抗菌药物以及新生儿GBS感染的诊断提供依据。
材料和方法
一、材料
1.研究对象 收集同济大学附属第十人民医院产科门诊妊娠34～37周的孕妇生殖道拭子300例，入选者均为初产妇，孕周均通过核查末次月经时间及早、中孕期B超检查确认，近期无性交，无感染性疾病及抗菌药物应用史。
2.仪器与试剂 哥伦比亚血琼脂培养基（上海伊华生物公司），GBS增菌肉汤、GBS筛查培养基、37 ℃孵箱、Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司），1对特异引物（F：5'-CGGTTAATGAGGCTATTACTAGTG-3'；C：5'-ATCTGTTAAGGCTTCTACACGAC-3'）[生工生物工程（上海）股份有限公司]，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（宝生物工程有限公司），9700型基因扩增仪（美国MJ Rearch公司），电泳仪（上海天能公司），凝胶成像系统（美国伯乐公司）。
二、方法
1.GBS肉汤增菌 生殖道拭子在选择性增菌培养基如GBS增菌肉汤增菌后可以达到最佳敏感性。将拭子头以上5 cm剪下置于GBS增菌肉汤管（每管含增菌液9 mL），密闭，置37 ℃恒温孵育箱中过夜孵育。
2.血平板助孕瑜伽动作图解法菌种鉴定 样本经肉汤增菌后转种到血平板上，在37 ℃有氧条件下培养18～24 h。根据细菌的形态、溶血特性初步确定是否为链球菌，最终由革兰染色、Camp试验及Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定菌种。
3.GBS筛查培养基法菌种鉴定 GBS筛查培养基是一种选择性产色培养基，对GBS的鉴定能力已得到验证。该培养基是一种由不同种类的蛋白胨、3种显色底物和抗菌药物组成的培养基，如果在其上生长出浅粉色至红色菌落，则说明有GBS生长，其他细菌和酵母多数不在此培养基上生长或不产生典型菌落。样本经肉汤增菌后转种到GBS筛查培养基上，置37 ℃恒温孵箱中培养18～24 h。如果24 h后未见典型菌落，可将培养时间延长至48 h。GBS菌落在该培养基上产生粉色至红色色素，比较容易鉴别。见图1。
图1 GBS筛查培养基上GBS的形态
4.常规PCR 应用常规PCR检测GBS基因组特异的协同溶血素蛋白因子。针对美国国家生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）GenBank上公布的GBS cfb基因序列（GeneID为1014854）设计1对特异引物。PCR步骤为：（1）制备细菌DNA模板。将-70 ℃低温保存的菌种肉汤置于室温下复溶，接种100 μL在血平板上，放入37 ℃恒温孵箱中培养18～24 h，取分离培养后的单个菌落，用1 mL ddH2O制备成菌悬液，装入已灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，100 ℃ 10 min，14 086×g离心5 min，取上清液作为扩增模板。（2）PCR扩增。PCR反应总体积为20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，最后用ddH2O补足20 μL。95 ℃预变性2 min；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。（3）产物分析。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，100 V电泳45 min后，在紫外凝胶电泳成像仪下观察结果，在预计位置112 bp处出现条带，为cfb基因。（4）产物序列分析。取1例阳性扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。
三、统计学方法
采用SPSS 20.2软件进行统计分析。计数资料以百分率表示，不同方法阳性检出率差异采用χ2检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、GBS特有序列的检测
序列分析表明，本研究样本特异性扩增产物与GenBank中目的基因片段（编码协同溶血素蛋白因子序列）完全一致，与cfb基因目标序列同源。
二、2种细菌培养法阳性检出率的比较
300例样本增菌后分别转种血平板和GBS筛查培养基，GBS阳性检出率分别为5.3%（16/300）和7.0%（21/300），二者差异无统计学意义（P＞0.05）。
三、PCR与细菌培养法结果的比较
全部临床菌株均进行PCR检测，阳性29例，阳性检出率为9.6%，与上述2种细菌培养法阳性检出率比较差异有统计学意义（P＜0.05），PCR阳性检出率明显高于细菌培养法。对PCR与2种细菌培养法检测结果不一致的3例细菌重新扩增，并将产物外送进行测序验证，结果3例均检出GBS特有的cfb基因序列。
讨 论
1938年Fry首次报道3例患者死于GBS引起的产后心内膜炎，现已证实GBS为围产期母婴感染的主要致病菌之一。15%～35%健康女性中有生殖道和消化道GBS生存，一般情况不致病，但孕妇感染时可表现为菌血症、泌尿系统感染[4]。有研究显示，妊娠妇女的GBS带菌率为10%～30%，可以母婴垂直传染的方式传给婴儿，剖宫产也并不能完全避免对婴儿的传染，围产期携带GBS的孕妇其生育的子女患早发型新生儿疾病的比例比非携带者高25倍，围产期携带GBS是早发型GBS感染的主要危险因素[5]。流行病学显示，在妊娠末期进行GBS筛查，对阳性患者采取积极预防和治疗措施，可有效降低GBS感染。在上世纪90年代由美国CDC制定了围产期GBS的防治指南，产前筛查降低了新生儿GBS感染的发生率[6]，目前约90%的妊娠35～37周孕妇开展GBS培养筛查，新生儿GBS感染率明显下降，这也引起我国学者的重视[7]。但围产期GBS防治尚在起步阶段，产妇GBS带菌情况不作为常规检查，也无大样本的流行病学资料，仅在有条件的地区开展筛查和诊断性检查。
常规样本送检从采样到最后上机检测可能要经过24～48 h，送检过程中由于细菌死亡和降解，GBS核酸可能会损失。美国最新版围产期GBS防治指南指出，采用合适的增菌液运输样本可有效维持GBS活力，更有利于GBS检出[8]。边佳明等[9]将送检样本及时放入增菌液过夜增菌再进行PCR，发现确实有效地提高了GBS的阳性检出率。可见，在培养前对送检拭子适当增菌可提高检测方法的敏感性，没有增加过多的操作步骤和延迟检测时间，可操作性强，提高了阳性检出率，也避免了假阴性的出现。因此，我们将样本及时过夜增菌，以便更好地对检测方法进行评估。
细菌培养是诊断GBS感染最经典的常规方法，但至少要24～48 h才能得到结果，GBS筛查在孕期35～37周进行，所以不会对孕妇产检产生太大影响。但因有5%～8%的GBS不产生β-溶血环，所以细菌培养有假阴性结果。因为缺少了分娩中的抗菌药物预防，所以增加了新生儿感染风险。GBS筛查培养基上目标菌为中等大小、浅粉至红色的菌落，通过颜色易于辨认，但因要在培养基上所有显色菌落中辨认出GBS，对专业技术也有一定的要求，假阳性结果会导致给予不必要的抗菌药物治疗，虽不会对产妇及新生儿产生太大的影响，但导致了抗菌药物的过度使用。本研究中转种GBS筛查培养基法阳性检出率为7.0%，稍高于转种血平板法（5.3%），此方法更加敏感，但那些不产生β-溶血环的菌株也不一定产生粉色至红色色素，导致至少5%的受感染孕妇未能及时得到预防和治疗。荧光定量PCR被认为是检测GBS准确性及敏感性高的方法，检测周期短，结果稳定且操作简便，可在检测过程中进行全程监控[10-13]。与传统方法相比，PCR结果更加准确。但其对人员、设备要求较高，从而限制了其应用。由于实验条件限制，本研究采用常规PCR进行检测。
妊娠妇女GBS带菌率易受检测方法、样本采集部位、样本采集时间、种族等影响，同时还有地域的差异性。有报道，北京地区孕妇带菌率为7.10%[14]，桂林地区为7.50%[15]，江西地区为8.76%[13]，河北秦皇岛地区为9.50%[16]。本研究PCR的GBS阳性检出率为9.6%，传统血平板法和GBS筛查培养基法分别为5.3%、7.0%。本研究GBS阳性检出率稍高，可能因为增菌肉汤中的抗菌药物抑制了大部分革兰阴性菌的生长，且同时有助于GBS生长之故，这与陆庭嫣等[17]研究结果符合。与直接接种相比，增菌后再培养的GBS阳性检出率明显提高，还可能与地域差别有关。
本研究显示， PCR对妊娠末期孕妇GBS的阳性检出率高于培养法，符合从传统微生物学技术转到分子生物学技术的发展趋势。因PCR技术尚处于研发的初期，部分方法对成本、技术和设备要求高，临床推广尚有一定的困难。但我们认为GBS检测技术的发展应向简便、快捷、经济、高通量、高准确性的方向发展，以满足临床快速筛查的需要。
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